根据现有研究报道，酵母菌的活性受化学因素（如高浓度葡萄糖）、物理条件（如温度）、培养条件（如营养物质）、菌龄等诸多因子的影响，而酵母菌在压力条件下对山梨酸钾和游硫二氧化硫相关的研究较少，为此，本实验对酵母菌在不同压力条件的起泡葡萄酒中的耐受性进行研究，以探索完善该技术难题。

　　1.实验方法

　　1.1酵母菌纯化

　　将活性干酵母活化进行单菌落分离，涂布培养，制得纯种酵母菌。

　　1.2 菌液制备

　　将酵母菌溶于生理盐水中制得酵母菌原液，即100液，然后再逐级稀释制成10-1液、10-2液、10-3液。

　　1.3  接种培养

　　用起泡葡萄酒混气机和等压灌装机等专业设备分别生产0.20MPa和0.40MPa两种压力下的酒样若干瓶，其中每个压力下在打塞前分别添加上述100液～10-3液酵母菌液1mL、山梨酸钾按照0mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L梯度适量添加（按照750mL/瓶计，下同），游硫二氧化硫按照 0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L梯度添加，打塞后置于25℃生化培养箱中培养，定期观察酒体变化情况。

　　1.4 酵母菌计数

　　将接种液（或经培养的酒样）吸1mL于培养基上培养，计算酵母总数。

　　1.5 酒体观察

　　用手电照经培养的酒样，记录酒体内部有混浊或沉淀出现的时间（天数），同时检测浊度，其余酒样继续培养。

　　2.结果

　　2.1 酒样初始指标的测定

　　酒样经过滤、混气、灌装等工艺处理后，两个压力下的基本指标为：0.20MPa酒样：CO2:4.3g/L，游硫二氧化硫：18mg/L，酒精度：6.0%vol，残糖：55g/L（以葡萄糖计），总酸：6.0g/L（以酒石酸计）；0.40MPa酒样：CO2:7.6g/L，游硫二氧化硫：18mg/L，酒精度：6.0%vol，残糖：55g/L（以葡萄糖计），总酸：6.0g/L（以酒石酸计）。以山梨酸钾和游离二氧化硫0 mg/L添加量作为实验空白酒样。

　　2.2 酵母菌接种液的浓度计数

　　为了准确了解接种液中的酵母菌浓度情况，需要对接种液进行培养计数（平行实验），以掌握酒样接种后酒中的实际菌浓，经测定：酵母原液（100液）的菌浓为5.6×106个/mL。

　　2.3 酒样接种酵母菌的山梨酸钾作用实验

　　山梨酸是一种短链的不饱和脂肪酸，可以被人体的代谢系统吸收而迅速分解为二氧化碳和水，在体内无残留，是国家标准中允许添加的高效安全防腐剂，生产中常用其钾盐的存在形式山梨酸钾，通过抑制微生物体内的脱氢酶系统，对霉菌、酵母菌有很强的抑制作用。

　　实验将山梨酸钾的添加浓度分别设为0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L，目的在于考察0.20MPa和0.40MPa两个不同压力条件下不同山梨酸钾浓度对酵母菌生长繁殖的抑制作用。关于山梨酸钾实验的结果见表1、2。

　　从表1，表2可以看出：

　　⑴ 接种100酵母菌液后，在0.20MPa和0.40MPa两个不同压力条件下，酒体都出现了严重的浑浊现象，最终的浊度都＞7.0NTU，说明在此酵母菌浓度下即使添加200mg/L的山梨酸钾仍不能达到抑制菌体生长和繁殖的目的。但在0.20MPa压力下酒液开始变化的时间和最终浑浊时间都比0.40MPa下的更早，说明压力对酵母菌的生长和繁殖具有一定的抑制作用。

　　⑵ 接种10-1酵母菌液后，两个压力条件下，酒体也都出现了较为严重的浑浊现象，说明此酵母菌浓度下山梨酸钾仍不能起到作用，但开始变化的浊度和最终表现浊度都比接种100酵母菌液的稍低，说明酵母菌的接种量直接影响浊度等酒液外观指标。在0.20MPa压力下酒液开始变化的时间和最终浑浊时间仍都比0.40MPa下出现的更早，与100酵母菌液表现规律一致。

　　⑶10-2的酵母接种浓度，酒体已经不会出现严重浑浊的现象，在0.20MPa压力下，山梨酸钾在150mg/L时酒体就未出现异常变化；0.40MPa压力下，山梨酸钾在100mg/L时酒体未出现异常变化；说明此酵母菌浓度时，在0.20MPa和0.40MPa两个压力条件下，山梨酸钾对酵母菌产生有效抑制作用的添加浓度范围分别为：100～150mg/L、50～100mg/L。

　　⑷10-3的酵母接种浓度，两个压力条件下，酒体均未出现异常变化，说明在此酵母浓度下，在压力存在时，即使0mg/L的山梨酸钾添加量，压力也对酵母菌的生长和繁殖产生胁迫。
2.4 酒样接种酵母菌的游离二氧化硫影响实验

　　在添加山梨酸钾的同时，需要考虑游离二氧化硫与山梨酸钾对酵母菌生长抑制的协同作用，根据上述实验初步确定0.20MPa和0.40MPa压力下山梨酸钾浓度为150 mg/L、100 mg/L，在此基础上考虑对游离二氧化硫的浓度进行梯度实验。

　　将游离二氧化硫的梯度浓度定为0 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L酒样的初始游离二氧化硫浓度为18mg/L，通过计算加入适量双氧水使其浓度达到上述梯度值。具体实验结果见表3、4。

　　从表3，表4可以看出 ：

 　　(1)接种100酵母菌液后，在0.20MPa和0.40MPa两个不同压力条件下，酒体都出现了严重的浑浊现象，最终的浊度都＞7.5NTU，说明在此酵母菌浓度下即使60mg/L的游离二氧化硫仍不能达到抑制菌体生长和繁殖的目的。但在0.20MPa压力下酒液开始变化的时间和最终浑浊时间都比0.40MPa下的更早，说明压力对酵母菌的生长和繁殖具有一定的抑制作用。

　　⑵接种10-1酵母菌液后，两个压力条件下，酒体也都出现了较为严重的浑浊现象，说明此酵母菌浓度下游离二氧化硫仍不能起到作用，但开始变化的浊度和最终表现浊度都较接种100酵母菌液有延迟和降低。在0.20MPa压力下酒液开始变化的时间和最终浑浊时间仍都比0.40MPa下的出现的更早，与100酵母菌液表现规律一致。

　　⑶10-2的酵母接种浓度，在0.20MPa压力下，酒体仍出现浑浊现象，但在0.40MPa压力下，游离二氧化硫在40mg/L时酒体即未出现异常变化；说明此酵母菌浓度时，0.20MPa压力和游离二氧化硫的协同胁迫并未对酵母菌产生明显作用，而在0.40MPa压力下，协同胁迫作用明显，此压力下游离二氧化硫产生有效抑制作用的添加浓度范围分别为20～40mg/L。

　　⑷10-3的酵母接种浓度，在0.20MPa压力下，游离二氧化硫的添加量直至60mg/L时酒体才未出现异常变化，说明在此压力和酵母菌浓度下，游离二氧化硫产生协同胁迫的有效作用浓度范围为40～60mg/L。而在0.40MPa压力下，酒体均未出现异常变化，说明在此压力和酵母菌浓度下，即使0mg/L的游离二氧化硫添加量，压力也对酵母菌的生长和繁殖产生胁迫。

　　3.结论与建议

　　⑴ 当酵母接种量达到7500个/ mL酒样时，6～8d后酒体会因酵母的生长繁殖开始出现沉淀。酵母接种量越低，酒体出现沉淀或浑浊程度就会越小，出现的时间就会越晚；山梨酸钾的添加浓度越大，开始出现酵母繁殖现象的时间就越晚，根据实验结果，建议在0.20MPa和0.40MPa两个压力条件下，山梨酸钾添加浓度范围分别为：100～150mg/L、50～100mg/L。

　　⑵ 对酵母的生长抑制作用来讲，游离二氧化硫和山梨酸钾之间存在协同抑制作用，总体来看，山梨酸钾对微生物的抑制作用更强，当游离二氧化硫浓度较低时，微生物的繁殖较快，且对酒体造成的浑浊和沉淀影响更为明显，且压力也对酵母菌产生生存胁迫，压力越高越明显。从实验中可以得知，建议在0.20MPa和0.40MPa两个压力条件下，游离二氧化硫添加浓度范围分别为：40～60mg/L、20～40mg/L。

　　⑶ 从微生物安全和感官质量角度综合考虑，建议对于0.20MPa左右的低泡葡萄酒产品山梨酸钾使用浓度范围为100～150mg/L、游离二氧化硫浓度为30～40mg/L（浓度过高会对感官产生刺激，影响消费者体验）；0.40MPa左右的高泡葡萄酒产品山梨酸钾使用浓度范围为50～100mg/L、游离二氧化硫浓度为20～30mg/L。但无论何种类型的产品，灌装前均应通过除菌过滤，确保装瓶的酒液中无任何酵母菌的存在。
 
　　作者简介

　　李泽福：四川人，齐鲁工业大学硕士研究生。 中共党员，国家级葡萄酒评酒委员、中国食品工业协会葡萄酒国家评委、蓬莱产区酿酒协会副主任、济南大学泉城学院蓬莱葡萄酒学院客座教授。现任中粮长城葡萄酒（烟台）有限公司总工。先后获得“全国轻工行业技术能手”、“山东省轻工行业技术能手”、“年度10佳酿酒师”、“首届中国葡萄酒行业最具魅力酿酒师”、“中国葡萄酒行业金牌酿酒师”、“烟台五一劳动奖章”、“蓬莱市优秀专业技术人才”等荣誉。