西北农林科技大学葡萄酒学院和合阳葡萄试验示范站的董喆、袁春龙、闫小宇等人对葡萄与葡萄酒中多酚氧化酶的近60篇文献进行了分析和总结。

　　PPO的分类及在葡萄中的分布

　　根据其所存在的生物类型及参与反应类型的不同将PPO分为单酚单氧化酶（如酪氨酸酶（tyrosinase）、甲酚酶（cresolase），EC 1.14.18.1）、双酚氧化酶（如儿茶酚氧化酶（catechol oxides），EC1.10.3.2）和漆酶（laccase，EC 1.20.3.1）。这些酶由不同的基因编码产生，具有不同的活性。

　　许多植物的PPO是由多基因家族编码的，例如在马铃薯和番茄基因中，分别有6、7 个PPO基因。有研究者却发现在葡萄藤中只有1 种PPO基因，有几种基因在PPO的代谢途径中起关键作用。而且在葡萄植株生长发育期的浆果、枝叶和根部基因得到大量表达，在成熟生长期时只有少量表达，可能与它的功能有关。

　　PPO的空间结构及催化褐变机理

　　>>>>PPO的空间结构

　　模型显示了PPO生物发生模型中的转化肽、催化单元（CuA和CuB）和C端延伸，两个箭头所指处为断裂位点，酶原的N端和C端肽键断裂形成成熟蛋白质。PPO的Cu原子结合区是酶的主要功能区，其他部分则对酶的构象、高级结构的形成和维持起作用。中间高度保守的Cu原子结合区富含组氨酸残基，每个Cu与3 个组氨酸残基以配位键相连，形成了有特定三维结构的活性部位。

　　研究人员从雷司令（Riesling）和丹菲特（Dornfelder）葡萄中提取PPO，进行分子动力学模拟分析之后发现，在其晶体结构中一个保守的苯丙氨酸占据着单体酚酶活性部位CuA的入口。如果催化底物是单体酚，单体酚的羟基通过快速复杂的空间位阻效应，苯丙氨酸259转动而连接到CuA上。

　　>>>>PPO催化褐变的机制

　　目前主要有3 种假说解释褐变机理，分别是：酚酶区域分布假说、自由基伤害假说、保护酶系统假说。其中国内外普遍认可酚酶区域分布假说。本课题组认为只有PPO、多酚类底物、氧3 个条件同时具备时才有可能发生酶促褐变。不同品种、不同成熟度植物的多酚类物质含量不同，PPO的含量、种类也不同，导致酶促褐变机制也会不同。

　　在PPO酶促反应中，反应过程呈S型曲线。在反应开始的一段时间内，反应速率与酶的纯度、底物的浓度成正比，但是随着反应的进行，PPO缓慢朝着一个更适应于底物结合、有着更高催化活性结构的方向进行变构，说明在反应过程中，PPO的结构尤其是活性中心并不是一成不变的。

　　PPO对葡萄与葡萄酒的影响

　　PPO在有氧条件下能催化单酚形成邻苯二酚，邻苯二酚氧化形成相应的邻醌、醌。形成的醌进一步经过复杂的反应形成黑色或褐色的沉积物。这一系列反应被认为是引起植物体发生酶促褐变的主要原因，直接导致果蔬品质劣变和营养成分的破坏。

　　影响PPO活性的因素

　　>>>>品种差异

　　研究者在葡萄抗感白腐病品种苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammoialyase，PAL）、PPO和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性比较实验中发现，选取的5 个葡萄品种中，对照组并没有做任何处理，但是贝达的PPO活性明显高于其他4 个品种20多倍。之后分析了27 种酿酒红葡萄品种PPO活性，发现不同酿酒红葡萄品种PPO活性之间存在显著差异，其中黑后的PPO活性最高，其次是佳丽酿和赫尔松。

　　>>>>温度

　　PPO的本质是蛋白质，适宜温度在30～50 ℃，且耐热性不强。一般经70～90 ℃处理3 min，PPO活性部位三维结构的完整性会被破坏，导致其部分或全部失活。低温条件同样能影响其活性。温度变化对于葡萄中PPO活性有很大影响，高温和低温都有利于抑制葡萄中PPO活性，从而减少褐变的发生。并且在较高温度下，PPO活性破坏较多甚至全部失活，但是高温时间过长会对酒中其他物质造成危害，因此在实际应用中，高温短时处理可能会是防止褐变处理的一个研究方向。

　　>>>>pH值

　　葡萄中PPO最适宜pH值在4～7之间，超出其范围酶活性迅速下降。这是由于PPO是含铜蛋白质，在pH＜2的酸性环境中，酶中的铜被解离出来，并且蛋白质也容易变形，从而使酶失活；而在pH＞9的碱性条件下铜会解离成氢氧化铜，使酶活性显著降低。

　　PPO抑制剂在葡萄酒酿造过程中的研究与应用

　　酶促褐变是相当迅速的。因此本课题组要采取一定的措施控制酶促褐变，一个重要方面就是抑制PPO活性。目前，工艺中使用最多的是添加PPO抑制剂。

　　>>>>SO2

　　研究者发现SO2能够不可逆地与氧化型和过渡型的PPO发生络合作用，从而抑制PPO活性。在HSO3－作用下，PPO活性中心的Cu2+被还原成更易失去电子的Cu＋形式，使酶受到不可逆抑制；在有氧条件下，SO2还可能以自由基为中介对酶分子中组氨酸残基产生降解作用。

　　>>>>有机酸

　　近几年，有机酸在酿酒工艺中使用增多，尤其是柠檬酸与抗坏血酸，原因是有机酸可能对PPO活性中心的铜离子位点具有较强的螯合作用，另一方面可能是其对葡萄酒中pH值的影响，进而影响PPO的活性。

　　>>>>乙二胺四乙酸

　　乙二胺四乙酸是目前广泛应用的食品金属鳌合剂，有抗氧化作用。其钠盐易溶于水，常温下可与PPO活性中心的铜离子形成稳定的水溶性络合体，与其他鳌合剂相比，具有更高的稳定系数。

　　展  望

　　目前关于葡萄酒氧化褐变的研究较多地关注于葡萄酒中氧化底物或加入抗氧化物质，由于在葡萄汁中的氧化褐变主要是以酶氧化为主，所以研究氧化褐变反应中的重要物质——PPO有重要意义。

　　通过对PPO基因的研究，在基因水平上调节特定组织或者器官PPO基因的表达，从而减少PPO对果蔬的危害部分；在PPO对植物有利的区域更多地表达，从而充分发挥其有利作用，也是对葡萄中PPO研究的一个重要方向。

　　在葡萄酒工艺及贮藏过程中，采取相应的措施抑制PPO活性，减少对酒的危害。抑制剂的使用量、使用时间、抑制机理等也需要进一步探索。